• 专利附录
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  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:

    公开号:WO1985005635A1
    申请号:PCT/DE1985/000193
    申请日:1985-05-30
    公开日:1985-12-19
    发明作者:Detlef Wilke；Alfred Weber
    申请人:Schering Aktiengesellschaft；
    IPC主号:C12P17-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zur Herstellung von α-Ergokryptin
    [0002] Die Erfindung betrifft das in dem Patentanspruch gekenn¬ zeichnete Verfahren.
    [0003] α-Ergokryptin = 9,10 -Dihydro-12'-hydroxy-2'-(1-methylethyl)- 5'α-(2-methylpropyl)-ergotaman-3 ' ,6' ,18-trion ist bekannt¬ lich pharmakologisch wirksam. Nach den bisher bekannten Verfahren wird es aber auf fermentativem Wege nur im Gemisch mit anderen Ergotalkaloiden und Peptidalkaloiden erhalten (Deutsche Offenlegungsschrift 31 04 151). Demzufolge ist seine Herstellung und Isolierung sehr aufwendig.
    [0004] Es wurde nun gefunden, daß ein Pilzstamm Claviceps spec. α-Ergokryptin in hohen Ausbeuten und neben Spuren von Agroclavi und ansonsten frei von anderen Ergotalkaloiden in das Kul¬ turmedium ausscheidet. Dieser Stamm Claviceps spec. wurde aus einem Mutterkorn eines wild wachsenden Schlickgrases der Species Spartina alterniflora isoliert. Er hat die interne Bezeichnung SCHERING, MBCE 5227 und ist bei der deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter der Nummer DSM 2836 hinter¬ legt. Der Stamm bildet auf Agarmedien mit Saccharose als Kohlenstoffquelle und Asparagin, als Stickstoffquelle flache, gelbliche Kolonien aus kompakten Mycel. Der Koloniendurchmesser beträgt nach 7 Tagen Kulturzeit 2 bis 3 cm und nach 20 Tagen Kulturzeit 6 bis 8 cm. Auf Agar-När edium mit Saccharose als Kohlenstoffquelle und Ammoniumsuccinat oder Ammoniumeitrat als Stickstoff¬ quelle bildet der Pilz langsam wachsende,, gewölbte und von der Agar-Oberfl che leicht abgehobene gelblich braune Kolo¬ nien. Die Kolonie hat eine durch Luftmycelbildung rauhe, insidiöse Oberfläche. Der Kolonienrand ist ausgefranst. Der Durchmesser der Kolonie beträgt nach 14 Tagen 2 bis 3 cm und nach 30 Tagen 6 bis 7 cm. Neben hyphenartigen Mycel treten kurze, runde bis unregelmäßig geformte, häufig in Ketten liegende und mit stark lichtbrechenden Vakuolen angefüllte Zellen auf (sklerotialer Zelltyp). Der Hyphen- durchmesser beträgt 3 bis 4 μm. Die vakuolisierten Zellen haben einen Durchmesser von 6 bis 10 μm und eine Länge von 10 bis 25 μm.
    [0005] Das erfindungsgemäße Verfahren wird unter Bedingungen durch¬ geführt, die man üblicherweise zur Anzucht von Pilzkulturen für eine Stoffwechselsynthese anwendet. So werden zunächst in allgemein üblichen Vorversuchen die günstigsten Fermenta- tionsbedinungen, wie z. B. die Auswahl des günstigsten Nähr¬ mediums, der technischen Bedingungen wie Temperatur, Belüftung pH-Wert und der optimalen Zeiten für die Germination und die Entwicklung des Mikroorganismus ermittelt.
    [0006]
    [0007] - 3 -
    [0008] Als Kohlenstoffquelle kann für das Fermentationsmedium bei¬ spielsweise Glucose oder Saccharose verwendet werden. Als Stickstoffquelle dient unter anderem Asparagin, Ammoniumsuccina oder Ammoniumsulfat. Ferner enthält das Medium die nötigen Wuchsstoffe (beispielsweise Hefeextrakt) und Mineralstoffe (Kalium-, Magnesium-, Kalzium-, Eisen- und Zink-Kationen, sowie Sulfat, Phosphat, Nitrat und Chlorid- Anionen) in der üblicherweise angewendeten Konzentration.
    [0009] Die Fermentation kann ein- oder zweistufig erfolgen, wobei das für die Vorkultur verwendete Medium mit dem der Haupt¬ kultur identisch sein oder von diesem verschieden sein kann. Für die Vorkultur wird vorzugsweise Glucose als Kohlenstoff¬ quelle verwendet, für die Hauptkultur vorzugsweise Saccharose. Das Vorkulturmedium enthält vorzugsweise 10 bis 100 mg/1 Kohlenstoffquelle, das Hauptkulturmedium vorzugsweise 100 bis 300 mg.
    [0010] Zu Beginn der Fermentation wird der pH-Wert des Mediums vorzugsweise in einem Bereich von 4 bis 6 eingestellt. Die Züchtungstemperatur liegt im Bereich von etwa 10 bis 35° C, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 30° C. Die Kultur¬ bedingungen sind streng aerob. Die optimale Fermentations¬ zeit wird durch Analyse des gebildeten α-Ergokryptins in üblicher Weise ermittelt.
    [0011] Nach erfolgter Fermentation wird das gebildete α-Ergokryptin in an sich bekannter Weise isoliert, beispielsweise indem man die Fermentationsansätze mit einem nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Ethylacetat, Methyliso* butylketon, Dichlormethan, Chloroform oder Tetrachlorethan extrahiert, die Extrakte einengt und das erhaltene Rohprodukt durch Chromatographie und/oder Kristallisation reinigt.
    [0012] Das nachfolgende Ausführungsbeispiel dient zur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
    [0013] - 5 -
    [0014] Beis pi el
    [0015] Claviceps spec. DSM 2836 wird auf einem Nährmedium angezüchtet, welches folgende Komponenten enthält:
    [0016] Saccharose (100 g/1), Citronensäure (10 g/1), Hefeextrakt (0,1 g/1), Kaliu dihydrogenphosphat (500 mg/1), Magnesium¬ sulfat-Heptahydrat (300 mg/1), Ammoniumsulfat (6 g/1), Calciumnitrat-Tetrahydrat (1 g/), Eisensulfat-Heptahydrat (7 mg/1), Zinksulfat-Heptahydrat (6 mg/1), Agar (16 g/1). Das Nährmedium ist auf pH 5,1 eingestellt. Die Anzuchtskultur wird 5 bis 20 Tage lang bei 30° C im Brutschrank aufbewahrt.
    [0017] Ein ca. 1 cm2 großes Mycelstuck wird mittels eines Ultraturrax unter sterilen Bedingungen in 5 ml physiologischer Kochsalz¬ lösung zerkleinert und damit 50 ml eine Vorkultur enthaltend Glucose (100 g/1), Citronensäure (7,5 g/1), Kaliumdihydro¬ genphosphat (0,59 g/1), Magnesiumsulfat-Heptahydrat (300 mg/1), Ammoniumsulfat (6 g/1), Eisen(II )-sulfat-Heptahydrat (7 mg/1), Zinksulfat-Heptahydrat (7 mg/1), Calziumnitrat-Tetrahydrat (1 g/1), Hefeextrakt (0,1 g/1) - eingestellt auf pH 5,1 - die sich in einem 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, beimpft und auf einem Rundschüttler 4 Tage lang bei 24° C und 220 Umdrehungen pro Minute kultiviert.
    [0018] 5 ml der so erhaltenen Vorkultur werden in 80 ml eines Me¬ diums enthaltend Saccharose (200g/l), Citronensäure (10 g/1), Hefeextrakt (0,1 g/1), Kaliumdihydrogenphosphat (500 mg/1), Magesiumsulfat-Heptahydrat (300 mg/1), Ammoniumsulfat (6 g/1), Calciumnitrat-Tetrahydrat (1 g/1), Eisensulfat-Hepta¬ hydrat (7 mg/1) und Zinksulfat-Heptahydrat (6 mg/1) - einge¬ stellt auf pH 5,1 - die sich in einem 500 ml Erlenmeyerkolben befindet, überführt und 9 Tage lang bei 24° C auf einem Rundschüttler mit 240 Umdrehungen pro Minute geschüttelt. Dann wird das Kulturmedium abfiltriert und der Gehalt an α-Ergokryptin mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (Fresenius Z. Anal. Chem. 303, 1980, 208) ermittelt. Die Konzentration des Kulturfiltrates beträgt 525 mg/1.
    权利要求:
    Claims

    Patentanspruch
    Verfahren zur Herstellung von α-Ergokrypt,in, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß man den Mikroorganismus Claviceps pas¬ pali DSM 2836 kultiviert und das gebildete α-Ergokryptin nach Beendigung der Fermentation isoliert.
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
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    DE3420953A1|1985-12-05|
    HUT38396A|1986-05-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1985-12-19| AK| Designated states|Designated state(s): HU JP US |
    1985-12-19| AL| Designated countries for regional patents|Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    1986-01-28| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1985902482 Country of ref document: EP |
    1986-06-11| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1985902482 Country of ref document: EP |
    1989-01-04| WWG| Wipo information: grant in national office|Ref document number: 1985902482 Country of ref document: EP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DEP3420953.0||1984-06-01||
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